Застосування білкової інженерії, Бібліотеки пептидів та епітопів - Білкова інженерія
Технологія білкової інженерії використовується (часто - у поєднанні з методом рекомбінантних ДНК) для поліпшення властивостей існуючих білків (ферментів, антитіл, клітинних рецепторів) і створення нових протеїнів, що не існують у природі. Такі білки застосовуються для створення лікарських препаратів, при обробці харчових продуктів та у промисловому виробництві [8].
Нині найпопулярнішою сферою застосування білкової інженерії є зміна каталітичних властивостей ферментів розробки «екологічно дружніх» промислових процесів. З погляду охорони навколишнього середовища ферменти є найбільш прийнятними з усіх каталізаторів, які у промисловості. Це забезпечується здатністю біокаталізаторів розчинятися у воді та повноцінно функціонувати в середовищі з нейтральним рН та при порівняно низьких температурах. Крім того, завдяки їх високій специфічності, в результаті застосування біокаталізаторів утворюється зовсім небагато небажаних побічних продуктів виробництва. Екологічно чисті та енергозберігаючі промислові процеси, що використовують біокаталізатори, вже давно активно впроваджуються хімічною, текстильною, фармацевтичною, целюлозно-паперовою, харчовою, енергетичною та іншими сферами сучасної промисловості.
Однак деякі характеристики біокаталізаторів роблять їх використання у ряді випадків неприйнятним. Наприклад, більшість ферментів розпадається у разі підвищення температури. Вчені намагаються подолати подібні перешкоди та збільшити стабільність ферментів у суворих умовах виробництва за допомогою методів білкової інженерії [18].
Крім промислового застосування, білкова інженерія знайшла собі гідне місце у медичних розробках. Дослідникисинтезують білки, здатні зв'язуватися з вірусами та мутантними генами, що викликають пухлини, та знешкоджувати їх; створюють високоефективні вакцини та вивчають білки-рецептори клітинної поверхні, які часто є мішенями для фармацевтичних препаратів. Вчені, які займаються вдосконаленням продуктів харчування, використовують білкову інженерію для покращення якостей білків, що забезпечують збереження продуктів рослинного походження, а також желюючих речовин або загусників.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей [4].
Бібліотеки пептидів та епітопів
У живому організмі більшість біологічних процесів управляється за допомогою специфічних білок-білкових або білково-нуклеїнових взаємодій. До таких процесів відносяться, наприклад, регуляція транскрипції генів під дією різних білкових факторів, взаємодія білкових лігандів з рецепторами на поверхні клітин, а також специфічне зв'язування антигенів відповідними антитілами. Розуміння молекулярних механізмів взаємодії білкових лігандів з рецепторами має велике фундаментальне та прикладне значення. Зокрема, розробка нових лікарських препаратів білкової природи зазвичай починається з ідентифікації вихідної послідовності амінокислот, що має необхідну біологічну активність (так звана "основна" (lead) послідовність). Однак пептиди з основноюпослідовністю амінокислот можуть мати і небажані біологічні властивості: низька активність, токсичність, мала стабільність в організмі і т.п.
До появи бібліотек пептидів поліпшення їх біологічних властивостей здійснювали шляхом послідовного синтезу великої кількості аналогів та перевіркою їхньої біологічної активності, що вимагало великих витрат часу та засобів. Останніми роками з'явилася можливість з допомогою автоматичних синтезаторів створювати протягом короткого часу тисячі різних пептидів. Розроблені методи спрямованого мутагенезу також дозволили різко розширити кількість білків, одержуваних одночасно і тестуються послідовно на біологічну активність. Однак тільки недавно розроблені підходи до створення бібліотек пептидів призвели до отримання мільйонів послідовностей амінокислот, необхідних для проведення ефективного скринінгу з метою виявлення серед них пептидів, що максимально задовольняють критеріям, що висуваються. Такі бібліотеки використовуються для дослідження взаємодії антитіл з антигенами, отримання нових інгібіторів ферментів та антимікробних агентів, конструювання молекул, що мають необхідну біологічну активність, або надання нових властивостей білкам, наприклад антитілам [23].
За способами одержання бібліотеки пептидів поділяються на три групи. До першої групи можна віднести бібліотеки, одержані з використанням хімічного синтезу пептидів, у яких індивідуальні пептиди іммобілізовані на мікроносіях. При такому підході після приєднання чергових амінокислот в індивідуальних реакційних сумішах до пептидів, іммобілізованих на мікроносіях, вміст всіх реакційних сумішей об'єднують і поділяють на нові порції, які використовують на наступній стадії приєднання нових амінокислотнихзалишків. Після проведення низки таких етапів виявляються синтезованими пептиди, що містять послідовності використаних у синтезі амінокислот у різних випадкових поєднаннях.
Бібліотеки пептидів, іммобілізованих на мікроносіях, мають істотний недолік: вони вимагають при скринінгу використання очищених рецепторів, що знаходяться в розчинній формі. У той же час у більшості випадків при біологічних випробуваннях, що проводяться для фундаментальних та фармакологічних досліджень, найчастіше знаходять застосування рецептори, асоційовані з мембранами. За другим способом бібліотеки пептидів отримують за допомогою твердофазного синтезу пептидів, при якому на кожній стадії хімічного приєднання чергової амінокислоти до пептидних ланцюгів, що ростуть, використовують еквімолярні суміші всіх або деяких амінокислот-попередників. На кінцевій стадії синтезу проводять відокремлення пептидів від носія, тобто. переведення їх у розчинну форму. Третій підхід до конструювання бібліотек пептидів, до опису якого ми зараз переходимо, став реальним завдяки розвитку методів генної інженерії. Він чудово ілюструє можливості таких методів і, безперечно, є великим досягненням у їх застосуванні. У цьому розглянемо докладніше результати використання бібліотек пептидів у вивченні епітопів (антигенних детермінант) білків [24].
Генно-інженерна технологія отримання гібридних білків дозволила розробити ефективний метод напрацювання коротких пептидів для аналізу їхньої біологічної активності. Як і у випадку клонотек генів, бібліотеки пептидів, отримані генно-інженерними методами, є великим (часто вичерпним) набором коротких пептидів. Два нещодавно зроблені спостереження дозволяють розглядати бібліотеку пептидів.одночасно і як бібліотека епітопів білків. По-перше, короткі пептиди можуть включати всі основні залишки амінокислот, які відіграють головну роль у взаємодії з антитілами, і вони можуть імітувати великі антигенні детермінанти білків. По-друге, у більшості випадків нековалентні зв'язки, що утворюються між небагатьма найбільш важливими залишками амінокислот білкових лігандів та їх рецепторами, роблять основний внесок у загальну енергію взаємодії ліганд-рецептор. З огляду на це будь-який пептид можна розглядати як потенційний ліганд, гаптен або частину антигенної детермінанти більших поліпептидів, а будь-яку бібліотеку пептидів - як бібліотеку епітопів білків або потенційних лігандів для відповідних білкових рецепторів.
Бібліотека пептидів, отримана в результаті реалізації третього підходу, в сучасному вигляді являє собою набір десятків або навіть сотень мільйонів коротких послідовностей, що різняться, амінокислот, які експресовані на поверхні віріонів бактеріофагів у складі їх власних структурних білків. Це стає можливим завдяки введенню методами генної інженерії геном бактеріофагів гібридних рекомбінантних генів, що кодують змінені структурні білки його віріонів. (Цей метод відомий під назвою фагового дисплея.) В результаті експресії таких генів утворюються гібридні білки, на N або С-кінцях яких присутні додаткові послідовності амінокислот.
Бібліотеки пептидів та епітопів знайдуть своє застосування і у дослідженнях механізмів гуморальної імунної відповіді, а також захворювань імунної системи. Зокрема, більшість аутоімунних захворювань супроводжується утворенням аутоантитіл проти антигенів власного організму. Ці антитіла у багатьох випадках служатьспецифічними маркерами тієї чи іншої аутоімунного захворювання. З використанням бібліотеки епітопів, в принципі, можна отримати пептидні маркери, за допомогою яких можна було б стежити за специфічністю аутоантитіл під час розвитку патологічного процесу як в індивідуальному організмі, так і в групі пацієнтів і, крім того, визначати специфічність аутоантитіл при захворюваннях невідомої етіології .
Бібліотеки пептидів та епітопів потенційно можуть бути використані також для скринінгу імунних сироваток з метою виявлення пептидів, що специфічно взаємодіють із захисними антитілами. Такі пептиди імітуватимуть антигенні детермінанти патогенних організмів та слугуватимуть мішенями для захисних антитіл організму. Це дозволить використовувати подібні пептиди для вакцинації пацієнтів, які не мають антитіла проти відповідних патогенів. Вивчення епітопів за допомогою бібліотек пептидів є окремим випадком одного з численних напрямів їх використання у прикладних та фундаментальних дослідженнях взаємодії лігандів та рецепторів. Подальше вдосконалення цього підходу має сприяти створенню нових лікарських препаратів на основі коротких пептидів і корисним у фундаментальних дослідженнях механізмів білок-білкових взаємодій [6].