Лабораторні методи специфічної алергодіагностики
Ці методи можуть широко використовуватися при алергічних захворюваннях у фазі загострення, в періоди масивного контакту з алергеном, при високій чутливості хворих на алерген, при наявності протипоказань, у дітей, при ідентифікації професійних алергічних захворювань, тому що виключають можливість появи неспецифічних, хибноалергічних реакцій.
Серед різних способів специфічної алергодіагностики при реагіновому IgE-залежному типі переважно визначення моноклональних IgE.
Існують непрямі методи визначення IgE та найпоширеніші прямі методи виявлення специфічних IgE, засновані на нових технологіях та використанні діагностикумів у вигляді стандартизованих та сертифікованих алергенів до них.
Реакція пасивного перенесення по Праустнітцю-Кюстнеру(непрямий метод постановки шкірної проби) частіше використовується в дитячій практиці при ідентифікації харчової алергії. Сутність методу полягає у реакції пасивного перенесення реципієнту сенсибілізації за допомогою внутрішньошкірного введення 0,1 мл сироватки крові хворого з наявністю в ній передбачуваних специфічних IgE. Через 24 години в цей же ділянку вводять 0,02 мл передбачуваного алергену. Реакцію реєструють за 20 хв. Однак загроза перенесення СНІДу, вірусного гепатиту та інших інфекцій не дозволяє широко використовувати цей метод.
Визначення специфічних IgE
Дослідження загального IgE здійснюється за допомогою паперового радіоімуносорбентного тесту (метод PRIST), визначення аллергоспецифического IgE - радіоаллергосорбентного тесту (метод RAST). Поряд з ними в даний час для визначення аллергоспеціфіческіх IgE все ширше використовується спосіб імуноферментного аналізу (ІФА).
Метод RAST найбільш специфічний іточний, оскільки ґрунтується на використанні радіоактивної мітки. Сутність його полягає у зв'язку специфічного IgE досліджуваної сироватки з алергеном, розміщеним на паперовій платівці. Після відмивання неспецифічного (загального) IgE вміст додаються мічені 125I антитіла проти IgE. Радіоактивний комплекс, що утворився, зчитується на сцинтиляційному лічильнику.
Сироватка обстежуваного, що містить специфічні IgE, нашаровується на поверхню полістирольну мікропланшет з адсорбованим набором алергенів, з якими зв'язуються тільки певні специфічні IgE.
При точковому імуноаналізі алергени наносяться як точок на нітроцелюлозні диски.
Поряд з виявленням специфічних lgЕ використовуються й інші лабораторні тести для діагностики як антитілозалежних реакцій (реакцій сповільненого) крові – РТМЛ, тест розеткоутворювальних клітин – РОК, тест ушкодження нейтрофілів та ін.).
Їхнє застосування в алергологічній практиці не втратило свого значення — ідентифікація підвищеної чутливості до алергенів, аутоантигенів дозволяє здійснювати більш цілеспрямоване лікування та реабілітацію хворих.
Реакція прямого специфічного ушкодження базофілів крові
Базофіли крові, огрядні клітини - клітини-мішені у реалізації алергічних реакцій негайного типу. lgЕ за допомогою Fс-фрагмента фіксуються на рецепторах мембран цих клітин, а за допомогою Fаb-фрагменту специфічно реагують з алергеном. Це супроводжується різкою активацією (дегрануляцією) клітин-мішеней, що і використовується якмаркера алергічної реакції.
Для постановки реакції 5 мл досліджуваної крові додають центрифужную пробірку з 5 краплями 6 % водного розчину трилону Б і інкубують протягом години при 37 °С. Суспензію лейкоцитів, що утворилася, за допомогою пастерівської піпетки переносять у чисту пробірку, а потім розливають у дві центрифужні пробірки по 0,3 мл. У першу пробірку (дослідну) додають 0,1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, в якому розчинена робоча доза алергену, в другу (контрольну) - 0,1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію без алергену.
Обидві пробірки інкубують протягом 10 хв при 37 °З, потім центрифугують протягом 10 хв при 1500 об/хв. Після чого зливають надосадову рідину, а лейкоцитарну масу, що залишилася на дні пробірки, обережно струшуючи, розбивають у залишку рідини, що стікає зі стінок. За допомогою пастерівської піпетки вміст кожної пробірки переносять на окремі предметні стекла (у вигляді краплі на край) і шліфованим краєм іншого скла готують тонкі лейкоцитарні мазки.
Мазки забарвлюють еозин-метиленовим синім по Май-Грюнвальду протягом 1-2 хв після просушування повітря. Після промивання препарату у метиловому спирті мазки-препарати мікроскопують з імерсією (збільшення 10 х 80). Прораховують 50 базофілів по краях мазка та кількість пошкоджених середніх клітин. Показник пошкоджених клітин у дослідному та контрольних препаратах визначають за формулою:
Реакція вважається позитивною за показника 1,4 і вище.
Л.А. Дуєва із співавт. (1986) підібрали робочі концентрації та дози хімічних алергенів та антибіотиків для реакції прямого специфічного пошкодження базофілів крові (табл. 4).
Тест деструкції опасистих клітин
Для отримання суспензії опасистих клітин вводятьвнутрішньочеревно щуру 8-10 мл (миші - 2-5 мл) підігрітого до 37 ° С ізотонічного розчину хлористого натрію, приготовленого на 0,15 моль фосфатному буфері з рН 7,2, злегка масажують живіт. Суспензію опасистих клітин відмивають ізотонічним розчином хлористого натрію, потім центрифугують при 500 об/хв.
Суспензію опасистих клітин (0,02 мл) і сироватку хворого (0,02 мл) інкубують 15 хв при 37 °С, потім вносять 0,02 мл алергену в попередньо підібраної концентрації і знову інкубують 15 хв при 37 °С. Одномоментно готують три контролю: гладкі клітини без сироватки та без алергену; огрядні клітини з сироваткою без алергену; опасисті клітини з алергеном без сироватки.
Після забарвлення зразків 0,025% розчином толуїдинового синього або 0,3% розчином нейтральної фарби заповнюють суспензією опасистих клітин камери Горяєва і підраховують пофарбовані клітини, порівнюючи кількість гранульованих клітин у контролі та досвіді. Спостережувана дегрануляція опасистих клітин у випробуваному зразку вважається слабопозитивною за наявності 10—20 % дегрануляції, позитивної — при 21—40 %, різкопозитивної — при дегрануляції понад 40 % клітин проти контролем.
Концентрація алергенів, що не викликає спонтанної дегрануляції, для антибіотиків — 100—1000 ОД/мл, калію біхромату та йодиду, натрію хромату, сульфату нікелю — 0,01—0,1 % розчину, формальдегіду — 0,2—0,4 %. Побутові алергени використовують у дозі від 10 до 100 PNU.
Реакція пасивної гемаглютинації (РПГА) дозволяє виявляти антитіла до водорозчинних та водонерозчинних алергенів.
Реакція заснована на феномен аглютинації еритроцитів, сенсибілізованих in vitro до хімічних алергенів, при додаванні сироватки пацієнта, що містить антигаптенні антитіла.
Реакція гальмування міграції лейкоцитівкрові (РТМЛ) заснована на здатності сенсибілізованих Т-лімфоцитів (наприклад, гаптенів) виділяти лімфокін - фактор, що інгібує міграцію лейкоцитів. За допомогою РТМЛ розкривається реакція клітинного типу (неантителозалежна) до різних антигенів.