Методика проведення електрофорезу в агарозному гелі

Електрофорез(від електро- та ін.-грец. φορέω — «переношу») — метод поділу макромолекул, що відрізняються за розміром, молекулярною масою, просторовою конфігурацією, вторинною структурою або електричним зарядом. Вперше було відкрито професорами Московського університету П. І. Страховим та Ф. Ф. Рейссом у 1809 році.

Принцип методу

Молекули в буферному розчині мають електричний заряд, величина і знак якого залежать від pH середовища. При пропущенні електричного струму через розчин у ньому формується спрямоване електричне поле, напруженість якого вимірюється різницею потенціалів по кінцях ємності, в якій виробляється електрофорез. Під впливом поля молекули починають рух у бік катода чи анода. Швидкість руху залежить від величини заряду, розмірів та тертя навколишнього середовища. З часом суміш поділяється на фракції, що складаються з молекул, що рухаються з однаковою швидкістю. У сучасних експериментах робочий канал приладів для електрофорезу заповнюють гелем, що має структуру сітки. І тут основне впливом геть рухливість молекул та його ступінь поділу надають їх лінійні розміри. У деяких випадках може виникнути ситуація, коли особливо великі молекули не проходять через пори гелю.

Методика електрофорезу в агарозному гелі.

агарозному
Електрофорез в агарозному гелі в різних модифікаціях широко застосовується для поділу молекул нуклеїнових кислот, білків та інших макромолекул у біології та медицині. На водяній бані або в лабораторній печі плавлять суміш агарози, буфера та води. Потім охолоджують до 50-60 °C і заливають у форму. Лунки для нанесення робляться за допомогою гребінки. Досліджуваний зразок наносять у лунку за допомогою дозатора. Коли барвник,що міститься в лунки на початку експерименту, досягає кінця гелю, електрофорез зупиняють. Потім гель забарвлюють барвником, який зв'язується з молекулами, що досліджуються. Інтенсивність фарбування смуг барвника дає уявлення про концентрацію молекул у зразку. Крім концентрації, метод електрофорезу дозволяє визначити відносну молекулярну масу досліджуваних молекул, для цього крайню лунку поміщають набір маркерів молекулярної маси, який повинен повністю покривати діапазон молекулярних мас досліджуваної системи.

Вибір карсителя та буфера

Бромфеноловий синій та ксиленціанол можуть помітно заважати спостереженню фрагментів під UV. Барвник Cresol red сумісний із ферментативними реакціями, практично не заважає спостереженню під UV. OrangeG - найбільш рухливий барвник, практично завжди знаходиться поза "робочою зоною". Помітний під UV. Барвник у буфері потрібен лише для того, щоб зразок був легко помітний у лунці та гелі.

Найширше застосування агарозних гелів мають у дослідженнях, пов'язані з поділом нуклінових кислот. Останні мають досить значні негативний заряд, величина якого слабо залежить від pH розчину, внаслідок чого поділ на фракції відбувається в основному за рахунок відмінності в лінійних розмірах молекул. У таких експериментах використовують 0.089М Тріс-боратний, 0.05 Трсфосфатний та Тріс-ацетатний буфер. Варто зазначити, що при звичайному електрофорезі в гелі можна розділяти фрагменти нуклеїнових кислот, розмір яких не перевищує 50 тис п.н. Також часто з експерименту слід отримати оцінку розмірів молекул. І тому використовуються набори молекул відомої довжини. Наприклад, для реєстрації продуктів ампліфікації ДНК застосовується електрофорез у агарозному гелі у присутності бромистого еїтідія, який утворює з фрагментами ДНКстійке з'єднання впровадження, що проявляється у вигляді смуг, що світяться при опроміненні гелю УФ-випромінюванням довжиною хвилі 290-330 нм.