МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ СПАДЧИНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ ЛЮДИНИ
Найбільш адекватні методи, що забезпечують точну діагностику моногенних захворювань, ґрунтуються на дослідженні ДНК у районі певних генів. Незважаючи на те, що молекулярно-генетичні методи, як правило, дуже складні, трудомісткі та дорогі, дані, отримані в процесі ДНК-діагностики набагато точніші та інформативніші за дані інших аналізів. Відомо, що ДНК залишається незмінною протягом усього життя організму і однакова у всіх ядерних клітинах, що дозволяє використовувати для аналізу практично будь-які клітини організму, отримані на різних стадіях онтогенезу. Крім того, за допомогою ДНК-аналізу пошкоджений ген можна виявити не лише за наявності розгорнутої клінічної картини захворювання, а й до появи симптомів, а також у здорових гетерозиготних носіїв мутації в гені.
Предметом ДНК-діагностики може бути як дослідження гена з метою виявлення мутацій (прямий підхід ДНК-діагностики), так і аналіз сегрегації захворювання у певній сім'ї з поліморфними ділянками ДНК (маркерними локусами), тісно зчепленими з пошкодженим геном (непрямий підхід ДНК- діагностики). Пряма і непряма ДНК-діагностика заснована на методах, що дозволяють ідентифікувати невеликий, але певний фрагмент ДНК людини. Зазвичай для цього використовують блот-гібридизацію або ампліфікацію з подальшим аналізом отриманих зразків ДНК за допомогою електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі або радіоавтографії (гл. 18).
Прямі методи ДНК-діагностики використовуються у тих випадках, коли відомий ген, відповідальний за виникнення спадкового захворювання та основні типи його патологічних мутацій. Використання прямих методів ДНК-діагностики є доцільним для таких захворювань як муковісцидоз (мажорна мутація delF508), фенілкетонурія.(R408W), хорея Гентінгтона (експансія CTG-повторів) та ряду інших.
Головна перевага прямого методу – це висока, практично 100%, точність діагностики та відсутність необхідності ДНК-аналізу всіх членів ядерної родини. Виявлення мутації у відповідному гені дозволяє абсолютно точно підтвердити діагноз спадкового захворювання та визначити генотип усіх членів обтяженої сім'ї. Ще одна перевага прямої діагностики — можливість виявлення гетерозиготного носія патологічних мутацій у батьків померлого хворого та його родичів, що особливо актуально для аутосомно-рецесивних захворювань.
Основний недолік прямих методів полягає в тому, що для їх застосування потрібне знання точної локалізації патологічного гена в геномі, його екзон-інтронної структури та спектру його мутацій. Така інформація на сьогоднішній день доступна далеко не всім моногенних хвороб людини.
До недоліків прямих методів слід також віднести їх неповну інформативність, що пов'язано з наявністю широкого спектра патологічних мутацій в тому самому гені, що зумовлюють розвиток спадкового захворювання. Залежно від обсягу спектра мутацій певному гені, ця інформативність може широко варіювати. Частина сімей у цьому випадку залишається неінформативною для ді-
Таблиця 19.6.Інформативність прямих методів ДНК-діагностики для різних захворювань
агностики. Табл. 19.6 дає уявлення про інформативність прямих методів різних захворювань.
Непрямі методи ДНК-діагностики застосовують у тому випадку, якщо ген, ушкодження в якому призводить до захворювання, не ідентифікований, а лише локалізований на певній хромосомі, або коли методи прямої ДНК-діагностики не дають результату (наприклад,при значній протяжності та складній молекулярній організації гена, а також широкому спектрі патологічних мутацій у ньому). Непрямі методи ДНК-діагностики засновані на аналізі сегрегації в сім'ї алелей поліморфних маркерів, що знаходяться в тому ж хромосомному регіоні або тісно зчеплені з локусом захворювання. Поліморфні маркери, що використовуються для непрямої ДНК-діагностики, являють собою точкові заміни, делеції/інсерції,
повтори, поліморфізм яких обумовлений різною кількістю елементів у блоці.
Найбільш зручними для непрямої ДНК-діагностики визнані мікросателітні (мономер до 5 п.н.) та мінісателітні (мономер повтору складається з 5-60 п.н.) поліморфні маркери, поширені в геномі людини. Для абсолютної більшості відомих в даний час поліморфних сайтів такого типу був суворо показаний менделевський характер успадкування. Найбільш типовими серед мікросателітів є динуклеотидні повтори, а найпоширенішим з них - «СА»-повтор. Показано, що кластери СА-повторів зустрічаються в геномі в середньому кожні 30 тисяч нуклеотидних пар. У багатьох кластерах є від 10 до 30 динуклеотидних повторів і типова кількість алелів становить 4-8, що забезпечує високу інформативність маркера.
Для кількісної оцінки інформативності даного маркера введена величина, що отримала назву інформаційного змісту поліморфізму (PIC - від англ. Polimorphism information content), яка обчислюється за такою формулою:
Ця величина визначає ймовірність того, що вивчення генотипу дитини з досліджуваної сім'ї та її батьків за допомогою поліморфного маркера дозволить визначити: з яким з алелів у цій сім'ї зчеплене пошкодження.
Цінність поліморфного маркера для ДНК-діагностики залежить не тільки від його інформативності, але і генетичної відстані між маркером і пошкодженням в гені, так як точність оцінки генетичного ризику значною мірою визначається частотою рекомбінації між сайтом пошкодження і поліморфним локусом.
Застосування непрямих методів молекулярної діагностики передбачає також як обов'язковий попередній етап дослідження частоти алелей відповідних поліморфних сайтів в аналізованих популяціях, серед хворих і гетерозиготних носіїв мутацій, а також визначення ймовірності рекомбінації та нерівноваги по зчепленню між маркером.
Таким чином, основний недолік непрямих методів полягає в їх не 100% точності. Справді, можлива помилка обумовлена ймовірними рекомбінаціями між поліморфним локусом, що вивчається, і пошкодженням в гені, а величина цієї помилки визначається двома факторами: генетичною відстанню між поліморфним локусом і мутацією, що призводить до захворювання, і генетичним розміром самого гена. Очевидно, що для зменшення помилки необхідно використовувати маркери розташовані безпосередньо поблизу гена або навіть усередині нього. Проте, часто розмір критичної області локалізації гена становить кілька сантиморганід, крім того існують гени, що мають генетичний розмір 3-5 сантиморганід (наприклад ген дистрофіну). Для таких генів навіть при використанні внутрішньогенних маркерів величина помилки складе 2-3% на мейоз. Зі зростанням числа аналізованих мейозів помилка накопичуватиметься. Взагалі, точний розрахунок генетичного ризику при проведенні непрямої діагностики є досить складним математичним завданням. Типова помилка під час проведення непрямої діагностики становить 1—5%.
До недоліків непрямої діагностики слід віднести необхідність сімейного аналізу та обов'язкову впевненість у клінічному діагнозі, оскільки ні підтвердити, ні
спростувати його під час використання цих методів (на відміну прямих) неможливо. Крім того, непрямі методи ДНК-діагностики можуть застосовуватися тільки для монолокусних захворювань і неефективні для моногенних полілокусних хвороб. Справді, для таких захворювань існує кілька локусів, у яких необхідно проводити сегрегаційний аналіз і не зрозуміло, який із локусів вибрати.
Непрямі методи не вимагають знання структури гена та спектра мутацій у ньому. Необхідно лише мати інформацію про його локалізації. У цьому полягає основна перевага цих методів. Крім того, методи непрямої діагностики інформативні практично для всіх сімей, що звернулися, оскільки завжди є можливість серед поліморфних маркерів, зчеплених з локусом захворювання, знайти інформативний для даної сім'ї.
Золотий стандарт ДНК-діагностики на сьогоднішній день - комплексне використання і прямих і непрямих методів у кожному конкретному випадку: підтвердження результатів непрямої діагностики результатами прямої, і навпаки. Такий підхід дозволяє отримати найбільш точний та адекватний результат.