Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, PCR)
Спочатку сам принцип методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) був розробленийКері Мюллісом у1983 р. Відкриття ПЛР стало однією з найвидатніших подій у галузі молекулярної біології за останні 20 років, і за розробку ПЛР-аналізу Керрі Мюлліс вже в 1993 р. був удостоєний Нобелівської премії в галузі хімії.
Для здійснення, зазначених у визначенні процесів, необхідні три ключові компоненти : (1)службова матрицею молекула ДНК, що містить досліджуваний фрагмент; (2)ДНК-полімераза *, тобто фермент для виробництва копій ДНК та нуклеотиди, що використовуються ДНК-полімеразою для синтезу ДНК; (3)два праймери ПЛР ** – два короткі сегменти однониткової нуклеїнової кислоти, комплементарні початку досліджуваного фрагмента ДНК (зазвичай це послідовності з 15-20 основ, приєднуючись до цього фрагменту, праймери дозволяють запустити синтез ДНК, оскільки ДНК -полімераза здатна тільки додавати ланки).
* процедура ПЛР включає кілька високотемпературних етапів, тому використовуються термостабільні ДНК-полімерази; вони виділяються з термостійких бактерій, що у гарячих джерелах при температурах до 90°С; найчастіше це Taq-полімераза бактерій Thermus aquanticus, Tth-полімераза (Thermus thermophilus), Pwo-полімераза (Pyrococcus woesei); в даний час в ПЛР часто використовуються суміші полімераз з різними властивостями, включаючи штучно отримані модифікації природних ферментів
** Праймери можна замовити в біохімічній компанії або синтезувати за допомогою автоматизованого апарату, задавши програму необхідної послідовності нуклеотидів.
Оскільки процес ПЛР вимагає постійної зміни циклів з кількома різними температурами, сучасні апарати для ПЛР – термоциркулятори – працюютьв режимі швидкої зміни температури реакційної суміші за заданою програмою і здатні ампліфікувати фрагмент ДНК довжиною від 100 до 3000 пар основ протягом декількох годин, починаючи з мікрограма ДНК (що оптимально), але можуть почати процес з мільйонної частки мікрограма. В крайньому випадку, можна використовувати як вихідний матеріал ДНК з однієї клітини, такий як клітина сперми, і отримати більше 100 млрд. копій досліджуваного фрагмента.
Крім простого збільшення кількості копій ДНК ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом : зміна основ, зрощування фрагментів ДНК і т.д.
Проведення ПЛР-аналізу (PCR diagnostics) починається із забору матеріалу для дослідження. Забраний матеріал зі щіточки поміщають у контейнер із фізрозчином. Після забору проби якнайшвидше мають бути доставлені до ПЛР - лабораторії.
Проведення в лабораторії ПЛР-аналізу відбувається в три етапи : (1)виділення ДНК ; (2)ампліфікація ДНК-фрагментів ; (3)Детекція ДНК-продуктів ампліфікації.
(1)Виділення ДНК - це початковий етап проведення ПЛР-діагностики, суть якого полягає в наступному: лікар забирає у пацієнта матеріал для дослідження та піддає його спеціальній обробці. У процесі обробки відбувається розщеплення подвійної спіралі ДНК окремі нитки. У матеріал пацієнта додається спеціальна рідина, що розчиняє органічні речовини, що заважають чистоті проведення реакції. Таким чином видаляються ліпіди, амінокислоти, пептиди, вуглеводи, білки та полісахариди. В результаті утворюється ДНК чи РНК. Принцип методу ПЛР полягає у «будівництві» нових ДНК або РНК інфекцій. Без видалення клітинного матеріалу це неможливо. Кількістьчасу, витраченого на виділення ДНК, залежить від збудника інфекції та від виду використовуваного для дослідження методом ПЛР матеріалу. Наприклад, для підготовки крові до наступного етапу потрібно 1,5-2 години.
(2) Ампліфікація ДНК. Для здійснення наступного етапу ДНК-діагностики – ампліфікації ДНК – лікарі використовують так звані ДНК-матриці – молекули ДНК інфекцій, на які згодом відбуватиметься «клонування» ДНК. Вже згадувалося, що наявність повної ДНК інфекції необов'язково, щодо цього етапу досить невеликого шматочка молекули ДНК, властивий лише даному мікробу (інфекції). В основі ампліфікації ДНК і відповідно в основі всього принципу ПЛР-реакції лежить природний для живого процес добудови ДНК - реплікації ДНК, який здійснюється шляхом подвоєння одиничного ланцюжка ДНК. Почавши з одного-єдиного фрагмента ДНК, лікар-лаборант копіює його та збільшує кількість копій у режимі ланцюгової реакції: після першого циклу у вас вже є 2 фрагменти, після другого циклу – 4, після третього – 8, після четвертого – 16, потім 32 , 64, 128, 256 ... З кожним циклом відбувається подвоєння числа копій, і після двадцяти циклів рахунок вже йде на мільйони, а після тридцяти - на мільярди. Цикл триває лічені хвилини і зводиться до певної зміни температурного режиму дуже невеликому хімічному реакторі. Тут у розчині в достатній кількості знаходяться всі потрібні компоненти синтезу, насамперед, нуклеотиди А, Г, Т і Ц, а також проведені тонкі підготовчі хімічні операції для того, щоб з кожного готового відрізку ДНК відразу знімалася точна копія, потім з цієї копії - Знову копія, в цьому і полягає розгалужена ланцюгова реакція. Шляхом приєднання до ланцюга ДНК праймерів – штучно синтезованих«шматочків» ДНК (нуклеотидних пар), аналогічних ДНК мікробів (інфекції) - утворюються дві короткі, які з двох ланцюгів ділянок ДНК, спіралі, необхідні синтезу майбутньої ДНК. Синтез нового ланцюга відбувається шляхом добудування кожної з двох ниток ДНК. Процес ампліфікації відбувається за допомогою специфічної ділянки - ДНК-полімерази, що дала назву лабораторному методу. Полімераза виступає в ролі каталізатора реакції і стежить за послідовним прикріпленням нуклеотидних підстав до нової ланцюга ДНК, що росте. Таким чином, ампліфікація ДНК є багаторазовим збільшенням кількості копій ДНК, які специфічні, тобто властиві тільки певному організму. Немає необхідності добудовувати весь ланцюг ДНК, щоби побачити збудника інфекції. Потрібна тільки та ділянка, яка характерна для даної бактерії як для індивідуальності. Усі етапи ампліфікації, що численно повторюються, відбуваються при різних температурах. Для проведення ПЛР-аналізу використовується спеціально програмоване обладнання – ПЛР – термостат або ампліфікатор, який автоматично здійснює зміну температур. Ампліфікація проводиться за заданою програмою, що відповідає виду інфекції, що визначається. Залежно від програми та виду інфекції, що визначається, процес автоматизованої ПЛР займає від 2 до 3 годин.
(3) У процесі детекції продуктів ампліфікації проходить поділ отриманої суміші продуктів ампліфікації. До суміші додається спеціальні розчини, які наділяють фрагменти ДНК здатністю флуоресціювати - відбиватися оранжево-червоними смужками, що світяться. Свічення, що утворюється, видає присутність ДНК вірусів, мікробів або бактерій у забраному у пацієнта на ПЛР-аналіз матеріалі.
Метод ПЛР (у діагностиці інфекційних захворювань) має наступніперевагами :
1Пряме визначення збудників інфекційних захворювань. Багато традиційних методів лабораторної діагностики мають на увазі виявлення збудників захворювання за різними непрямими ознаками. Наприклад, ІФА-діагностика заснована на виявленні у крові пацієнта білків, які є продуктами розпаду інфекційних збудників, на підставі чого лікар може поставити той чи інший діагноз. Метод ПЛР-аналізу дає пряму вказівку на присутність у забраному у пацієнта матеріалі специфічної ділянки ДНК збудника хвороби.
2 Висока специфічність ПЛР-діагностики. У процесі проведення аналізу у досліджуваному матеріалі виділяється фрагмент ДНК, специфічний, т. е. властивий лише конкретному збуднику - лише певної бактерії чи вірусу. Дана ділянка ДНК унікальна і не характерна для жодної інфекції на землі.
3 Висока чутливість ПЛР. Виявлення інфекції можливе навіть у тому випадку, якщо у забраному у пацієнта матеріалі міститься лише одна клітина бактерії чи вірусу. Порівняно з іншими імунологічними та мікробіологічними методами діагностики: чутливість ПЛР-аналізу - 10-100 клітин у пробі, інші методи - 103-105 клітин.
4 Універсальність ПЛР-аналізу. Для ПЛР-дослідження може застосовуватися практично будь-які матеріали, у тому чилі недоступні для дослідження іншими методами: слиз, сеча, кров, сироватка, мокротиння, еякулят, зіскрібок епітеліальних клітин - оскільки інфекція може міститися в будь-яких біологічних виділеннях і тканинах.
5 Висока швидкість отримання результату ПЛР-аналізу. Єдиний для всіх метод обробки забраного на аналіз у пацієнта матеріалу, детекції продуктів реакції, автоматизована ПЛР-ампліфікація дозволяють провести повну ПЛР-діагностику за 4-5 годин. У той же час, на культуральні методи дослідження витрачається набагато більше часу — від кількох днів до кількох тижнів, оскільки необхідне виділення, а згодом і вирощування збудника на культурі клітин.
6 Можливість діагностики будь-якого виду інфекції. Висока чутливість методу ПЛР дозволяє діагностувати інфекцію не лише на гострій стадії захворювання, а й хронічні інфекції та навіть наявність поодиноких бактерій чи вірусів.
Говорячи про безперечне прогресивне значення методу ПЛР та його незаперечні переваги, водночас, слід знати і про певні недоліки цього методу та проблеми його проведення.
1 Ключовим фактором успішності процесу є, мабуть, правильний вибір послідовності праймерів. Можна використовувати програми, які значно спрощують пошук відповідних регіонів ДНК або навіть вибирають пару праймерів автоматично (наприклад, "Oligo" від molecular Bioligy Insights). Однак жоден із існуючих алгоритмів не забезпечує повної гарантії гарної роботи праймерів. До того ж насправді вони є сумішшю молекул різної довжини і складу, що призводить до появи "мінусових" фракцій – молекул з послідовністю, укороченою на одну або кілька підстав, при цьому положення пропущеного нуклеотиду може бути будь-яким. Тому для отримання найкращих результатів слід проводити очищення цих фракцій.
2 Слід також звернути увагу на приготування суміші чотирьох типів нуклеотидів. Нерівна їх концентрація веде до суттєвого збільшення помилок ДНК-полімерази під час ампліфікації. Необхідно також підтримувати відповідну концентрацію іонів магнію, оскільки зниження концентрації вільних катіонів впливає на температуру таСпецифіка гібридизації праймерів.
3 Надзвичайна чутливість методу вимагає суворого дотримання спеціального технологічного режиму, ретельного виконання всіх етапів аналізу в окремих ізольованих зонах лабораторії, оскільки існує ризик ампліфікації дуже невеликих кількостей неспецифічної ДНК, що призведе до неправильного діагнозу. До того ж ПЛР ідеально підходить для отримання відповідей типу "так-ні", наприклад, є у зразку Bacillus anthracis (сибірка) чи ні. Набагато менше цей метод придатний визначення, який організм з багатьох інших є у зразку. Причина в тому, що ПЛР найкраще працює, коли в тестовій реакції знаходиться лише одна або кілька пар праймерів. Якщо в одній реакції використовується велика кількість пар праймерів, які відповідають усім можливим збудникам інфекції, виникає серйозна проблема можливих артефактів.
4 Для правильної інтерпретації результатів необхідно також знати, що виявлення ДНК збудника не завжди говорить про стан його життєздатності, а також про безпосередній зв'язок виявленого інфекційного агента з конкретним патологічним процесом.
5 Для успішного проведення аналізу важливо правильно зібрати біоматеріал у пацієнта та правильно провести його підготовку. Відомо, що у лабораторній діагностиці більшість помилок (до 70%) відбувається саме на етапі пробопідготовки. В даний час для забору крові існують вакуумні системи, які з одного боку мінімально травмують пацієнта, а з іншого - дозволяють забрати матеріал таким чином, що він не контактує ні з персоналом, ні з навколишнім середовищем. Це дозволяє уникнути контамінації (забруднення) матеріалу та забезпечує об'єктивність аналізу ПЛР.
6Методики, що використовуються при екстракції нуклеїнових кислот, повинні максимально видаляти антикоагулянти (наприклад, гепарин) та залишки гему, щоб уникнути зниження ефективності ампліфікації. Системи з протеїнкіназами є більш ефективними порівняно з системами, що базуються тільки на застосуванні хімічних агентів. Деякі системи дозволяють виділяти одночасно вірусні ДНК і РНК, що дозволяє уніфікувати етапи виділення нуклеїнових кислот при визначенні в одному зразку ДНК-, так і РНК-вірусів-мішеней.
7 Слід також мати на увазі, що ДНК-полімерази, що використовуються в ПЛР, мають схильність до помилок. Однак основною проблемою застосування ПЛР у медицині є суттєве обмеження інформації про функції генів, що беруть участь у розвитку більшості хвороб людини. Сьогодні найчастіше відомі лише симптоми цих захворювань.