Що таке оптогенетика, CMT Науковий підхід

Можливість прати пам'ять або задавати нові спогади, керувати рухами та поведінкою здається долею фантастичних фільмів, але насправді цей спосіб вже з'явився і називається він «оптогенетика». У ній поєднуються воєдино знання про гени, закони оптичної фізики та чиста нейровізуалізація, що дозволяє точно картувати області різних функцій. Все, що вам потрібно – знайти ймовірні клітини, які можуть брати участь, наприклад, у процесах запам'ятовування, генетично їх змінити, вбудувавши світлочутливий білок, а потім підвести світло, яке в певний час їх «включатиме» або «вимикатиме». І все, «інструмент» з управління функціями мозку готовий.

Ілл: Wikimedia Commons

Звичайно, не варто переживати з цього приводу, оскільки генетичні модифікації з людським організмом поки що неприпустимі. Лікування різних захворювань методами генної терапії все більше набирає свою міць, але до того, поки вчені не навчаться точно контролювати хід такої терапії та уникати всі можливі найближчі та віддалені негативні наслідки, говорити про швидкі перспективи рано.

Однак оптогенетичні методи можуть стати потужною альтернативою застосуванню лікарських препаратів при лікуванні хвороби Паркінсона, депресії, епілепсії, тривожних розладів, і це вже науково доведений факт. Звичайно, поки тільки на лабораторних тварин, але все ж таки. Не дарма метод у 2010 році визнаний журналом Nature Methods «науковим методом року», а у статті журналу Science оптогенетика названа «проривом десятиліття» (Breakthrough of the Decade).

Ми вже писали про оптогенетику в питаннях і відповідях, тепер вирішили підготувати для вас великий і докладний матеріал.

Вчення – світло

Отже, що таке «оптогенетика»? Це порівняно молодий метод, який у 2017 році відзначатиме 12-річчя з моменту відкриття американським ученим зі Стенфорда Карлом Дейссеротом (Karl Deisseroth) можливості таргентного (спрямованого) управління нервовими клітинами через вбудовування в їхню мембрану світлоактивних білків. Дейссерот проте не був винятковим піонером у цій галузі, і з методикою йому «допоміг» Георг Нагель (Georg Nagel), який у 2003 році «пророкував» подібну можливість, вбудовуючи білок у яйцеклітини жаби та клітини культури зародка нирки людини.

Але спочатку з'явилася інша техніка, прототипом якої послужили наші очі, точніше, рецептори сітківки, що сприймають світло, в яких міститься білок родопсин. Він складається з білка опсину та кофактору ретиналю (похідний вітаміну А). Світло, потрапляючи на ретиналь, його деформує, це викликає структурну перебудову в білку, що веде до активації сигнальних шляхів усередині нейрона, викликаючи його збудження. Метод хороший, але складний у виконанні та дуже нестабільний. Хоча сама по собі ідея, висловлена ще в 1999 році Френсісом Криком (Нобелевська премія за відкриття структури ДНК) про те, що точково нейронами найзручніше керувати саме світлом, геніальна. Адже світло легко дозувати і доводити до потрібних клітин, що не під силу методам електрофізіології, які маніпулюють електричними розрядами та діють подібно до слона в посудній крамниці.

Але перші досліди з вбудовування родопсину в клітини були вдалими, оскільки нейрони активувалися дуже нестабільно, що ні влаштовувало дослідників. Поки не з'явилася ідея «підглянути» відповідну речовину у світлочутливих водоростей. Саме тут був відкритий той самий «знаменитим» канальний родопсин, що став згодом (ChR2),який якнайкраще підійшов експериментаторам за своїми властивостями.

Цікаво, що опсини вивчалися дуже широко як біохіміками, так і мікробіологами, і лише через багато десятків років нарешті з'явилася ідея про те, щоб «зустріти» мікробні білки та клітини ссавців. Виявилося, що різного роду опсини можуть не тільки збуджувати клітину, переносячи в неї позитивні іони (наприклад, той самий чаннелродопсин-2 – неспецифічний канал або бактеріородопсин та протородопсин – канали для Н+), але й пригнічувати генерацію потенціалів дії, гіперполяризуючи мембрану - Канал для Сl-). Нещодавно в тому числі нашими співвітчизниками відкриті й абсолютно нові опсини для негативних іонів, які набагато швидше реагують на фотостимуляцію, ніж родопсини.

Як це працює

Відповідь одна – через генетичну модифікацію клітини. Ми повинні взяти ген світлочутливого білка, додати до нього промотор, який «говоритиме» РНК-полімеразі, з якого моменту потрібно почати зчитувати з нього інформацію, а також приєднати так званий репортер, щоб перевірити, чи правильно ми доставили ген і чи експресується він . Найчастіше як нього використовується якийсь флуоресцентний білок (наприклад, жовтий YFP або зелений GFP).

Схема роботи з ChR2

Далі цей ген має бути доставлений у клітини, необхідні для вивчення. Тут також є кілька способів. Можна створити повністю генномодифікований організм, у якого необхідні нам гени вже на ембріональному етапі розвитку будуть вбудовані в геном. Це стабільніше, але отримання такого організму потрібні місяці, а чекати не дуже хочеться. Тому існує другий спосіб, що працює швидше: віруси, що несуть генетичну інформацію про родопсин. Вони теж модифіковані таабсолютно нешкідливі для експериментального організму, але не втратили своєї здатності вбудовуватися в нейрони і змушувати їх відтворювати свій геном. А нам це і потрібно – клітина, експресуючи гени, доставлені вірусом, сама себе постачає родопсинами, які входять у мембрану та готують її до «роботи».

Три складові оптогенетики: опсин, що вбудовується, носій гена білка-опсину, джерело світла

Тепер справа за малим – підвести до потрібного місця джерело світла. Для цього використовуються найтонші світлодіоди з оптоволокна, що добре проводять світлові імпульси. Також до них приєднуються електроди, що дозволяють отримати дані про електричну активність клітин. Така конструкція кріпиться до голови тварини зовні і абсолютно не заважає їй жити своїм власним життям, а ми отримуємо можливість спостерігати за тим, що відбувається з кожною конкретною клітиною в режимі реального часу, а також впливати на ці функції, варіюючи світлові імпульси.

Традиційні родопсини, з яких оптогенетика розпочала свою переможну ходу науковим світом, активуються синім світлом з довжиною хвилі 480 нм, яке погано проникає в глибокі тканини. Саме тому необхідний світлодіод, що вживлюється в мозок. Родопсини нового покоління вже «відгукуються» на світ червоний, який має набагато більшу силу проникнення, тому зараз дослідники навіть отримали можливість уникати інвазивного втручання. Що робить весь експеримент ще більш фізіологічними, а дані більш точними і максимально наближеними до реальності.

Помилкові спогади

Одну з найпоказовіших робіт, що демонструють силу оптогенетики, провели у США. Колектив японського вченого, нобелівського лауреата Судзумі Тонегава, який працює в RIKEN та в Массачусетськомутехнологічному університеті створив щурів з ченнелродопсинами-2 в областях гіпоталамуса, які відповідають за консолідацію пам'яті – її переведення з короткочасної до довготривалої, а потім проводив із ними низку експериментів.

Тварина запам'ятовувала, що, скажімо, в кімнаті А його били струмом і там треба боятися, і реагувало на це характерною поведінкою (завмирало та групувалося) навіть тоді, коли розряду не відбувалося. У цей момент активізувалися певні клітини, в які дослідники потім і впроваджували родопсин. У кімнаті Б все було добре, і тварина поводилася там як завжди до того моменту, поки за допомогою світлових імпульсів не «включали» генномодифіковані нейрони. Як ви вважаєте, що відбувалося з пацюками? Правильно, вони групувалися і починали пищати, відчуваючи страх, якому в даному контексті, здавалося б, не місце.

Ще більш елегантний експеримент та сама лабораторія зробила в 2015 році. Вчені продемонстрували, що при хворобі Альцгеймера спогади не зникають безвісти, а перезаписуються, і за допомогою оптогенетики їх можна повернути. З хворими модельними мишами проробляли те саме, що й в інших експериментах – лякали електричним струмом, лише за кілька днів вони про це забували.

Так ось, за допомогою оптогенетичної стимуляції не тільки виходило повертати «в життя» втрачені спогади, а й робити так, щоб вони не губилися знову. Для цього вчені впроваджували родопсин у сусідню область – ентеріальну кору, стимуляція якої призводила до формування нових зв'язків між нею та гіпокампом і, відповідно, зміцнювала пам'ять.

Знімок коронарного зрізу зубчастої звивини гіпокампа в мишачій моделі ранньої хвороби Альцгеймера, де зеленим свіченням позначені енграмні клітини пам'яті. Джерело: RIKEN.

Не тільки пам'ять і не лише родопсин

За допомогою оптогенетики дослідники також довели, що дофамінергічні нейрони середнього мозку – частини стовбура – крім усіх своїх функцій допомагають сприймати час.

Миші чули два звуки з більш короткочасними (менше 1,5 секунди) та більш тривалими (більше 1,5 секунди) проміжками. Якщо інтервал тривав довго, тваринам необхідно було відкрити ліві дверцята, і якщо проходив швидко, то праву. У разі правильної відповіді гризуни отримували нагороду. Коли клітини, що брали участь у цьому процесі, збуджували, то довгі проміжки сприймалися як короткі, і якщо придушували, навпаки.

У 2007 році з вини «оптогенетики» стало ясно, що для підтримки неспання ми маємо ще один тип нейронів, які виробляють так званий орексин або гіпокретин, без якого організм безконтрольно переходить у сон. Його виділяють лише близько 60 тисяч нейронів, які невеликими скупченнями знаходяться в бічних областях гіпоталамуса. Також оптогенетика «відкрила» шляхи порятунку від різноманітних залежностей, що в майбутньому напевно стане неоціненною допомогою в роботі психіатрів.

Крім цього можна вбудовувати родопсини в мембрани кардіоміоцитів, керуючи таким чином серцевим ритмом, а можна і зовсім створити «універсальних вбивць» — клітини, які під впливом світла будуть випускати в навколишній простір активні форми кисню, вкрай руйнівні і токсичні для живих мембран. Застосування такого виду клітин напевно зможе знайти в онкології. Оптогенетичними методами можна буде пригнічувати біль та відновлювати зір.

Світлочутливість, як виявилося, має не тільки родопсин. Є ґрунтові бактерії, у яких на світ реагують деякі ферменти, зокрема,аденілатциклаза, яка виробляє функціонально активну речовину цАМФ. Таким чином вдалося простимулювати регенерацію відростків нервових клітин, в які був введений цей самий фермент, оскільки чим більше цАМФ в клітині, тим активніше в ній відбуваються синтетичні процеси. Швидкість регенерації в цьому випадку зросла у 6 разів у порівнянні з тими клітинами, які перебували у темряві. Особливо цінним є те, що експерименти проводилися на живих рибах, і жодна з них не постраждала.

Що в Україні?

У 2012 році на базі Санкт-Петербурзького політехнічного університету під керівництвом Іллі Безпрозванного, професора Південно-Західного медичного центру Університету Техасу (США) та випускника Політехнічного інституту почала функціонувати лабораторія молекулярної дегенерації, яка стала північним оптогенетичним «центром».

Малюк даніо-реріо, керований термогенетичним методом. Фото Всеволода Білоусова

В останні роки лабораторії, що займаються методами оптогенетики, з'явилися також у МФТІ та Нижньому Новгороді.

Текст: Текст: Анна Хоружа Автор: Олексій Паєвський