Особливості формування постреперфузійного ушкодження нейронів - характеристика моделі
Вінницький національний медичний університет ім. Н.І Пирогова, Україна
Введение. На сьогоднішній день тромболітична терапія є одним з небагатьох лікувальних заходів ефективність якого при гострому порушенні мозкового кровообігу за ішемічним типом (ОНМК) з позицій доказової медицини є незаперечним [7]. При фармакологічному відновленні прохідності інфаркт-залежної церебральної судини важливим є досягнення її повної реканалізації. Це зумовлено тим, що збереження залишкових явищ стенозування може повністю нівелювати переваги цього методу, мета якого, перш за все, спрямована на зменшення розмірів некрозу і збереження життєздатності клітин. За даними літератури [9], реперфузія при ВНМК найбільш ефективна в перші хвилини розвитку судинної катастрофи та протягом наступних 3 годин. Надалі при її застосуванні значно зростає ризик не тільки реперфузійного ушкодження, а й геморагічних ускладнень. Враховуючи складність діагностики та проведення реканалізації, стає очевидним, що успішний тромболізис можливий у небагатьох випадках і лише у великих спеціалізованих клініках [12]. Однак навіть рання реканалізація пошкодженої судини далеко не завжди виправдовує очікування лікарів, оскільки часто після відновлення її прохідності можливе постреперфузійні пошкодження нейронів [8]. Це призводить до того, що нормалізація порушених функцій головного мозку відбувається лише через кілька годин або навіть доби після реперфузії, а в окремихУ випадках пізній тромболізис супроводжується ще більшим ураженням нервової тканини [11].
У зв'язку з цим, на думку фахівців [10,5], схему лікування таких хворих доцільно доповнювати препаратами з нейроцитопротекторними властивостями, що дозволяє продовжити період "терапевтичного вікна" та створює захист від реперфузійного пошкодження. На сьогоднішній день сформовано ключові принципи та патогенетично обґрунтовано доцільність включення препаратів цієї групи до складу інтенсивної терапії інсульту [6]. Невдачі, пов'язані з розробкою та впровадженням церебропротекторів до складу базисної терапії гострої церебральної недостатності, можна пояснити цілим комплексом причин. Однією з основних є невідповідність картини модельного ВНМК у деяких тварин, які традиційно використовують для цієї мети з клінічним перебігом інсульту у людини. Саме тому стратегія тестування перспективних нейропротекторів з метою «прикриття» тромболітичної терапії та нівелювання наслідків пізньої реканалізації потребує вдосконалення та деяких змін. По-перше, необхідно створити експериментальну модель церебральної ішемії-реперфузії, яка максимально відображала ті зміни, які мають місце при формуванні постреперфузійного синдрому. По-друге, з'ясувати, як у умовах відбувається реалізація різних типів клітинної смерті (нейроапоптоз і нейронекроз). Відповідь на останнє питання дозволить проводити цілеспрямований відбір нових сполук для глибокого вивчення можливих механізмів їхньої церебропротекторної дії. Особливого стратегічного значення це набуває у разі, якщо такі речовини здатні впливати на перші етапи «ішемічного каскаду», що дає можливість припустити наявність у них модулюючої дії на реалізацію різнихтипів нейрональної смерті у постреперфузійний період інсульту. Впровадження у широку експериментальну практику нових моделей гострої церебральної ішемії дозволило б детальніше оцінити ефективність потенційних нейропротекторів. Що в майбутньому, безумовно, зможе підвищити ефективність та безпеку тромболітичної терапії.
Мета роботи. Охарактеризувати особливості нейрональної смерті на моделі церебральної ішемії-реперфузії та дати оцінку її можливого використання для доклінічного дослідження потенційних нейропротекторів.
Матеріали та методи. Для вивчення особливостей реалізації різних типів нейрональної смерті в постереперфузійний період ОНМК нами як лабораторні тварини були обрані монгольські піщанки (гербели). Ці гризуни вважаються найбільш репрезентативними лабораторними тваринами для моделювання гострої ішемії головного мозку, оскільки (на відміну від щурів) мають роз'єднаний вілізійний круг кровообігу. Це дозволяє відтворити церебральну ішемію найбільш наближену до клінічних умов, що, безумовно, сприяє об'єктивній оцінці особливостей патогенезу та нейропротекторної активності нових біологічно активних речовин [2]. Як модель ОНМК була обрана модель односторонньої каротидної оклюзії, яку виконували під пропофоловим наркозом (60 мг/кг внутрішньочеревно). Оскільки тромболітичну терапію бажано проводити в межах «золотої години» ОНМК, частина тварин через 60 хв після перев'язки сонної артерії проводила реперфузію (знімали лігатуру). Дослідження було проведено на 52 статевозрілих гербелах масою 42-53 г, розбитих на 3 групи. Перша група – тварини, яким виконували незворотну каротидну оклюзію. Друга – гербели, яким через 60 хв після моделювання патологіїпроводили реканалізація каротидної артерії. Для нівелювання впливу пропофолу та хірургічного втручання замість інтактних тварин використовували хибно-оперовані гербели, яким виконували всі процедури, крім перев'язки сонних артерій (третя група).
Про активацію процесів нейронекрозу при незворотній ішемії та в постреперфузійному періоді інсульту судили щодо підвищення активності маркера нейрональної деструкції – нейрон-специфічної енолази (NSЕ). Енолаза є одним із ключових ферментів аеробного гліколізу. Її ізофермент - gg-енолаза або NSЕ - міститься переважно в нейронах та нейроендокринних клітинах. При неврологічних захворюваннях, у тому числі і при ОНМК, відзначається вихід нейрон-специфічних ферментів та їх ізоферментів з пошкоджених нейронів, що дозволяє досліджувати глибину та інтенсивність структурно-функціональних порушень біомембран у центральній нервовій системі (ЦНС) на ранніх етапах. Рівень NSE у сироватці крові пацієнтів з ОНМК корелює з об'ємом інфаркту головного мозку [4]. Для визначення рівня активності NSE на 4 добу ОНМК шляхом прямої візуальної пункції сагітального синуса проводили забір крові (V=0,2-0,4 мл). Активність NSE вимірювали методом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням набору NSE EIA KIT (DAI, США) на приладі фірми "Hipson" (Чехія). Відомо, що процес нейроапоптозу починається з руйнування ядра клітини та пошкодження дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК), тому наявність фрагментованої ДНК є маркером апоптозу [14]. Рівень фрагментації ДНК у ядрах нейронів лобових часток кори головного мозку гербел на 4 добу після ішемії-реперфузії досліджували методом проточної цитометрії [13]. Для отримання суспензії ядер до тканини додавали СуStain DNA фірми Partec (Німеччина) згідноінструкції виробника. Використовували одноразові фільтри CellTrics 50 мкм (Partec, Німеччина). Ядерні суспензії біоптатів кори лобових часток головного мозку гербел готували відразу після забору матеріалу та промивання холодним (+4-+8 оС) фосфатно-сольовим буфером рН 7,4 (Sigma). Дослідження проводили на проточному цитометрі "Partec РАS" фірми Partec, Німеччина. Для збудження флуоресценції мітки ядерної ДНК - діамідінофеніліндолу - використовували ультрафіолетову лампу. З кожного зразка ядерної суспензії проводили аналіз 10 тис. подій. Проточний аналіз фрагментації ДНК виконувався за допомогою програмного забезпечення FloMax (фірма Partec, Німеччина) шляхом виділення Sub-G1 ділянок на гистограммах ДНК. Статистичну значущість відмінностей оцінювали за критерієм Фішера (летальність) та за t-критерієм Стьюдента.
Результати. Отримані результати, що характеризують особливості перебігу різних варіантів ОНМК (без та з наступною реперфузією) наведені в таблиці. Приклади типових ДНК-гістограмів клітин кори головного мозку гербел представлено на рис.1, 2.
Таблиця 1. Співвідношення показника летальності тварин з перебігом нейродеструктивних та нейроапоптотичних процесів у головному мозку гербел з різними моделями інсульту на 4 добу експерименту
Примітки: 1. NSE – нейрон-специфічна енолаза; ОНМК – гостре порушення мозкового кровообігу; 2. статистично значущі відмінності (р
Список використаних джерел:
1. Войткова В.В. Вивчення апоптозу методом проточної цитофлоуметрії (огляд літератури)// Бюлетень ВСНЦ СО РАМН. - 2010. - № 6 (76), Ч. 1. - С. 220-225.
2. Доклінічне вивчення специфічної активності потенційних нейропротективних препаратів: метод. Рекомендації/І.С. Чекман, Ю.І. Губський, І.Ф. Бєлєнічєв та ін.Київ, 2010. - 81 с.
3. Манських В.М. Морфологічні методи верифікації та кількісної оцінки апоптозу// Бюлетень сибірської медицини. - 2004. - № 1. - С. 63-70.
4. Нейронспецифічні білки – маркери енцефалопатії при тяжкій поєднаній травмі/Е.В. Григор'єв, Г.В. Вавін, Т.Г. Гришанова та інших.// Медицина невідкладних станів. - 2010. - №2 (27). - С.72-76.
5. Роль антагоністів глутаматних рецепторів (ПК-Мерц) у лікуванні пошкоджень мозку (огляд літератури)/В.В. Ніконов, І.Б. Савицька// Медицина невідкладних станів. - 2012. - № 5 (44). - С. 36-40.
6. Раціональна нейропротекція/І.Ф. Бєлєнічєв, В.І. Черній, Ю.М. Колесник та ін. – Донецьк: Видавець Заславський А.Ю., 2009. – 262 с.
7. Рекомендації щодо ведення хворих з ішемічним інсультом та транзиторними ішемічними атаками (2008) Виконавчий комітет Європейської інсультної організації (ESO) та Авторський комітет ESO // Практична ангіологія. - 2008. - № 4. - С. 9-23.
8. Скворцова В.І., Голухів Г.М., Волинський Ю.Д. Висока ефективність селективного внутрішньоартеріального тромболізису при лікуванні ішемічного інсульту у хворих з оклюзією артерій великого калібру// Журнал неврології та психіатрії ім. С.С. Корсакова. - 2006. - Т. 106., № 12. - С. 32-40.
9. Про можливі шляхи профілактики реперфузії при критичних станах/Е.Л. Соболєва, Ю.П. Орлов// Сибірський медичний журнал. – 2012. – № 1. – С. 13-16.
10. Трошин В.Д., Бровков Н.М. Невідкладна кардіоневрологія. - М: Медичне інформаційне агентство, 2010. - 672 с.
11. Тромболітична терапія/В.І. Цілуйко, Н.Є. Міщук// Ліки України. - 2010. - № 8 (144). - С. 8-14.
12. Сучасна церебропротекторна терапія гострих порушень мозкового кровообігу при цукровому діабеті та шляхи їїоптимізації/В.В. Шведський, С.Ю. Штриголь, А.А. Ходаковський// Клінічна фармація. - 2011. - Т.15, №2. - С.7-12.
13. Шведський В.В., Штриголь С.Ю., Мерзлікін С.І., Черешнюк І.Л. Вплив діакамфу гідрохлориду на інтенсивність нейроапоптозу при експериментальному порушенні мозкового кровообігу на тлі цукрового діабету// Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2012. - №2. - С. 49-53.
14. Cell death in disease: від 2010 onwards/ R.A. Knight, G. Melino// Cell Death Dis. - 2011. - Vol. 2. - Р. 202.
15. Роль Апоптозиса в disease/ B. Favaloro, N. Allocati, V. Graziano et al.// Aging. - 2012. - №.5, Vol.4. - Р. 330-349.