Спосіб діагностики вірусних хвороб тварин
Використання: ветеринарія, вірусологія. Сутність винаходу: при діагностиці вірусних хвороб змішують антитіловмісну рідину від підозрюваних у захворюваннях тварин з еталонним вірусом. Суміш інкубують, вносять її в моношарову культуру клітин. Потім інкубують інфіковану культуру та враховують результати реакції. Як антитілосодержащіе рідини використовують лімфоцити. Спосіб дозволяє ідентифікувати збудник по ранній стадії захворювання.
ВІДОМСТВО СРСР (ГОСПАТЕНТ СРСР) ОПИС ВИНАХОДУ
ДО ПАТЕНТУ (21) 4924525/13 (22) 03.04.91 (46) 23.02.93. Бюл. N 7 (71) Всесоюзний науково-дослідний ящурний інститут (72) В.A,Ìèùåíêî, А.С.Толокнов, Є.В.Новожилова, А.І. Н.В.Міщенко, С.А.Рибакова та Н.Є.Балакіна (73) Всесоюзний науково-дослідний ящурний інститут (56) Сюрін В.М, та співавт. Методи лабораторної діагностики вірусних хвороб тварин, M., Агропроміздат, 1986, с. 207.
Винахід відноситься до галузі вірусології і може бути використане в діагностиці дослідженнях при вірусних інфекціях і визначенні імунного статусу тварин.
Відомий ряд способів аналізу вірусів (антигенів) імуноферментним методом (ІФ М).
Цей метод дозволяє за 16-24 години визначати виукраінспецифічні білки при їх концентрації не менше 1-10 нанограмів.
Істотним недоліком ІФМ, як і інших імунохімічних методів, є те, що вони дозволяють визначати лише віруси, які за антигенною структурою відповідають виробничому штаму. віукраінспецифічними антитілами і розмножується в чутливій системі, „„5U„„1797709 АЗ(Ял G 01 і 33/53, А 61 До 39/12 (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ВІРУСНИХ
ХВОРОБ ТВАРИНИ (57) Використання: ветеринарія, вірусологія, Сутність винаходу; при діагностиці вірусних хвороб змішують антитіловмісну рідину від підозрюваних у захворюваннях тварин з еталонним вірусом. Суміш інкубують, вносять її в моношарову культуру клітин. Потім інкубують інфіковану культуру і враховують результати реакції, Як антитіловмісні рідини використовують лімфоцити. Спосіб дозволяє ідентифікувати збудник на ранній стадії захворювання.
В даний час у вірусології широко використовується РН, яка дозволяє 2 ідентифікувати збудників, що викликали захворювання, та визначати імунний статус організму. PH вЂ" це найбільш універсальна, високоспецифічна реакція, тому вона служить еталоном в оцінці інших реакцій у вірусології.
PH заснована на здатності специфічних імунних сироваток нейтралізо- С) вати інфекційну дію вірусів, тобто. При контакті вірусу з сироваткою, що містить специфічні антитіла, нірус терне 1ча здатність до репродукції в чутливих системах. Суміш вірусу та сироватки зазнають на чутливій до цього вірусу системі культивування, Результати реакції нейтралізації вірусу враховують за відсутністю: а) загибелі або патологоанатомічних змін; б) цитопатичної дії, бляшкоутворення; r) гемаглютинінів.
Відомо багато різних модифікацій постановки РН щодо приготування сумішей вірус-сироватка, умов інкубування сумішей та обліку результатів PH. Для постановки pH використовують сироватку крові, отримані від заражених тварин.
Найбільш чутливим є титрування антитіл методом реакції бляшок.
Відомий спосіб діагностики вірусних інфекцій у РН,що включає такі операції:
2 вЂ" змішують розведення імунної сироватки, отриманої від хворих тварин, з постійною дозою вірусу і інкубують суміш протягом 1 години при 37 С;
3 вЂ" моношарову культуру клітин відмивають солоним розчином Хенкса і інокулюють сумішшю, отриманою згідно з п.2;
4 вЂ" реакцію інкубують 1 годину при 37 С, 5 вЂ" у флакони вносять агарове покриття;
8 вЂ" після застигання агару, флакони інкубують при 37°С протягом 72 годин; .
7 вЂ" облік результатів реакції проводять за кількістю редукованих бляшок. Тип вірусу відповідає типу імунної сироватки, що попередила розвиток бляшок у найвищому титрі.
Дань і спосіб взятий заявником як прототип як найбільш близький за технічною сутністю і результату, що досягається при використанні.
Істотним недоліком способу прототипу є тривалість ідентифікації збудника та постановки діагнозу на хворобу, у зв'язку з тривалістю отримання досліджуваного матеріалу, Відомо, що в сироватках крові тварин, заражених вірусом ящуру, антитіла до збудника з'являються до четвертого дня IgM, а до 14 д.
Цим пояснюється те, що для побудови постановки реакції використовують сиворфтки, отримані від тварин не раніше. що через 7-14 днів після захворювання.
Метою пропонованого винаходу є прискорення способу, Поставлена мета досягається тим, що у відомому способі діагностики вірусних хвороб тварин у РН, що включає змішування антитіловмісної рідини з вірусом, інкубування суміші при 3? З протягом 1 години, внесення її в багатошарову культуру клітин з подальшим інкубуванням, згідно з передбачуваним винаходом як антитілосодержащіе рідини використовують мононуклеарніклітини (лімфоцити) периферичної крові
Пропонований спосіб відповідає критерію винаходу "новизна", так як у порівнянні з прототипом він містить нову сукупність суттєвих ознак, виражену у формулі винаходу.
Відомості про сутність запропонованого рішення до невизначеного кола осіб не наводилися.
30 від відомого ознаками, що призводять до прискорення аналізу пропонованим способом, тобто, до позитивного ефекту, який невідомий в аналогічних рішеннях, відповідає критерію винаходу "суттєві відмінності".
Завдяки використанню нової сукупності відомих і відмітних ознак, що характеризують пропонований спосіб, досягається позитивний ефект, виражений у меті винаходу; скорочення часу на постановку діагнозу та ідентифікацію вірусу, що викликав забо, лівання, досягнення позитивного еф-. фекту, на нашу думку, можна пояснити
45 тим, що як джерело антитіл використовуються лімфоцити підозрюваних у захворюванні тварин.
Відомо, що після потрапляння в організм антигену відбувається комітування.
50 стовбурових клітин (лімфоцитів вЂ" попередників), Антитіла продукуються в невеликих кількостях (10 -10 молекул на клітину) і функціонують тільки як рецептори клітинної поверхні.
Поряд з цим у ранній період після введення антигену в організмі утворюються клітини пам'яті. Ймовірно, в цей же час при стимульованому антигенному розмноженні клону утворюються антитілосекретуючі клітини або з комутованих
1797709 попередників антитілоутворюючих розчином Хенкса без індикатора. Отриманий клітин, або з клітин пам'яті при повторний осад клітин ресуспендують у різній зустрічі з аналогічним антигеном, Відтворі Хенкса (1:10). Готують декілька пробхарактерна особливість В-лімфоцитів суспенеії лімфоцитів по 0,4 мл. До кожної полягає в тому, що на їх поверхні 5 пробі додають по 0,1 мл вірусу ящуру присутній легко збудливий імуногло- різних типів, адаптованих до культубулін, який відіграє роль рецептора для реклітин ВНК-21 і інкубують при 37ОС антигену. Проліферація та диференціювання-протягом 60 хв. Суміш центрифугують при ка B-лімфоцитів після їх взаємодії 1000 об/хв протягом 10 мл, надосадок з антигеном призводять до утворення кле- 10 інокулюють в культуру клітин ВЕК вЂ" 21. Інток, секретують імуноглобуліни. кубують 72 години при 37ОС, Облік результатів
Кожен малий В-лімфоцит має приблизно- проводять по ЦПД, приблизно 100000 молекул рецепторних ім- Результати досліджень, характернімуноглобулінів. Вже через 24 години після зуючих ефективність пропонованого введення вірусу (наприклад, ящура) на лім- 15 способу порівняно з прототипом, передфоцитах виявляються антигензв'язу- ставлені з таблицях, що ють ділянки антитіл, Після введення Приклад 2, Кров від підозрюваних інактивованого антиген відбирають у стерильні флакони з лімфоцитів антигензв'язуючі ділянки гепарином (20 од/мл крові). Лімфоцити виантитіл виявляються значно по- 20 ділять з плазми, яку одержують після зже, При змішуванні лімфоцитів, содер- слабкого центрифугування крові в течущих антигензв'язувальні центри ня 15 хв„при 900 — 1000 об/хв. Плазму антитіл, з вірулентним збудником про- відбирають в центрифужні пробірки, клетисходит освіту комплексів, які ки осаджують центрифугуванням при 1200 осаджували центрифугуванням, а недостатньо 25 об/хв вЂ" 15 хв. якщо в осаді присутню рідину відбирали і вносили в чутливі еритроцити, їх лізують додаванням 1ну культуру клітин, При цьому мл дистильованої води, протягом 30 розмноження вірусу в клітинах не відбувається, потім додають 10 мл середовища 199, дило. знову центрифугують, отриманий осад
Для пояснення сутності пропоновано- везикулярної хвороби свиней, до третього по го способу наводяться приклади його вико- 0,1 мл вірусу везикулярної екзантеми свізування, які не обмежують обсяг ній. Суміш інкубують 60 хвилин при 37°С винаходу. 40 потім центрифугують і надосадок ченцюПриклад 1. Кров від підозрюваного лируют у культуру клітин СП, Після інкубів захворюванні великої рогатої худоби отрування у флакони вносять агарову суміш . бирають у стерильні флакони з гепарином і після його застигання флакони інкубіру (20 од на мл крові), Мононуклеарні клітини ють при 37 ° С протягом 72 год. Облік результатів виділяють із стабілізованих 45 тов проводять за кількістю бляшок, Типової крові шляхом центрифугування в гра- віруса, що викликав захворювання, відповідно фіколл-паку ("Pharmacla" Швеція). е типу збудника, розмноження для цього в центрифужні пробірки поме- торого інгібується лімфоцитами щают 5 мл фіколла і обережно нашаровують хворої тварини, 5млгепаринізованої крові. Центрифу- 50 Приклад 3. Кров від заражених гують 40 хв при 2000 об/хв, при темпе- вірусами ящуру або імунізованих ано ратурі 18 С. Після центрифугування в . тигенамй вірусів БЕС або ВБС морських пробірці утворюється 4 шари: I вЂ" плазма, ll вЂ" свинок відбирають у стерильні флакони з лймфоцити,! І вЂ" фіколл, tV вЂ" гранулоцити та гепарином (20 од/мл крові). Надалі еритроцити. Завис лімфоцитів обережно 55 проводять дослідження так, як описано відбирають пастерівської піпеткою в центрі- прикладі 2. фужні пробірки і відмивають середовищем 199 . Результатицих досліджень шляхом 5-хвилинного цеітрифугування при ставлені в таблицях 2, 3 і 5, 1200 об/хв. Повторне відмивання лімфоци- Приклад 4, Кров відібрану до тов проводять збалансованим сольовим зараження і через три дні після инфициро1797709
Результати ідентифікації вірусу, що спричинив ящур у великої рогатої худоби.
Титр вірусу (Ig ТЦД5о) Дні відбору проб крові сиво откой і ототип лім про итами